棉棒花卉

Ⅰ 花卉類病毒的診斷和鑒定方法有哪些

類病毒因為不具有外殼蛋白，所以不能用血清學、電鏡等方法來診斷和檢測。類病毒常用的檢測方法有生物學檢測、雙向電泳、RT-PCR和分子雜交等方法。

1 生物學檢測

利用類病毒的特異鑒別寄主來診斷和檢測。如菊花矮化類病毒（CSVd），可以從待檢樣品中抽提低分子RNA，接種到特定的指不植物，如菊花的Mistletm品種、爪哇三七（Gynura auanyiana）、番茄（Lycopersicon esculentum）。接種緩沖液的組成是100mmolTris，10mmolEDTA，pH7.5。接種時用沾有接種原的剎須刀在菊花和爪哇三七的莖部輕輕切割5～10刀，再用棉棒塗抹。番茄可以用4～5葉期的幼苗直接用塗抹法接種。被接種植物放在30℃左右的溫室培育，觀察症狀。接種36d後，菊花上出現黃色斑點，頂葉較少，從上數第3～5葉上症狀更明顯。接種45d後，爪哇三七出現頂葉捲曲症狀。但沒有柑橘裂皮病類病毒接種時症狀明顯。接種60d後，番茄上不表現任何症狀。但回接菊花的Mistletm品種，證明CSVd在番茄上屬於潛伏侵染。

生物檢測需要嚴格的溫度條件，如果溫度條件控制不嚴格便難以得到可信的結果。此外，檢測批量樣品，還需要較大的空間。

22 雙向電泳檢測

2.1 核酸的抽提

抽提緩沖液的組成為0.13mol Tris-HCl、0.017mol EDTA、1mol LiCl、0.83%DS，5%PVP，簡稱為TESLP。1g鮮菊花葉片加2～5倍體積的TESLP緩沖液磨碎，加入等體積的水飽和酚∶氯仿（1∶1）處理，離心分離後用乙醇沉澱回收全核酸。之後用methoxy ethaml除去多糖，用CTAB回收核酸，加等體積的4mol的LiCl，離心回收2mol LiCl的可溶組分，用乙醇沉澱濃縮後溶於適當體積的TE（10mmol Tris-HCl，1mmol EDTA，pH8.0）溶液中。

2.2 正反向電泳

按照Singh等的方法進行。首先在室溫下用1倍TBE電泳緩沖液分離核酸，直到染料XC-FF達近底部的7.5%為止。然後換成加熱到沸騰的0.125倍TBE電泳緩沖液，顛倒正負極並用表面加熱器保持電泳板的溫度在80℃以上，直到染料XC-FF到達膠的上端。電泳完後用銀染色觀察核酸的有無（圖1）。

圖1 正反向電泳法檢測菊花矮化類病毒RNA示意圖

與生物接種相比，正反向電泳凝膠電泳檢測菊花矮化類病毒，可以從相當於2.8mg鮮重的菊花樣品中檢測到菊花矮化類病毒CSVd，並同時可檢測10～20個樣品材料。總之，制備用於正反向電泳的粗核酸的方法簡便，需要的鮮葉量少，可以作為該類病毒的常規檢測方法。正反向電泳凝膠電泳與雙向凝膠電泳比較，省去了第一項電泳完後割膠回收的試驗步驟，操作更為簡便。