丁香文獻求助

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❹ 求助：基因克隆轉化不成功的因素

基因克隆後需要在煙草內驗證功能
基因的克隆就是利用體外重組技術,將特定的基因和其它DNA順序插入到載體分子中。基因克隆的主要目標是識別、分離特異基因並獲得基因的完整的 全序列,確定染色體定位,闡明基因的生化功能,明確其對特定性狀的遺傳控制關系。通過幾十年的努力由於植物發育,生理生化,分子遺傳等學科的迅速發展,使 人們掌握了大量有關植物優良性狀基因的生物學和遺傳學知識,再運用先進的酶學和生物學技術已經克隆出了與植物抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆,育性、高蛋白質 及與植物發育有關的許多基因。我們實驗室對天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),為了克隆植物基因也探討了 其它克隆方法,本文論述基因克隆的策略、方法及取得的一些進展。
1功能克隆(functional Cloning)
功能克 隆就是根據性狀的基本生化特性這一功能信息,在鑒定和已知基因的功能後克隆(Collis,1995)。其具體作法是:在純化相應的編碼蛋白後構建 cDNA文庫或基因組文庫,DNA文庫中基因的篩選根據情況主要可用二種辦法進行,(1)將純化的蛋白質進行氨基酸測序,據此合成寡核苷酸探針從cDNA 庫或基因組文庫中篩選編碼基因,(2)將相應的編碼蛋白製成相應抗體探針,從cDNA入載體表達庫中篩選相應克隆。功能克隆是一種經典的基因克隆策略,很 多基因的分離利用這種策略。
Hain等從葡萄中克隆了兩個編碼白藜蘆醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合 物白藜蘆醇的存在,可以提高對灰質葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在煙草和其它一些植物中無二苯乙烯合成酶,因此克隆該基因經過轉基因後,對有些植物產生對灰質葡萄孢的抗性很有意義(Hain 等,1985)。Kondo等1989年對編碼水稻巰基蛋白酶抑制劑的基因組DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斕等構建了水稻 cDNA文庫,分離了編碼水稻巰基蛋白酶抑制劑的cDNA(周兆斕等,1996)。植物蛋白酶抑制劑是一類天然的抗蟲物質,它可抑制攝食害蟲對蛋白質的消 化,使害蟲因缺乏所需氨基酸而導致非正常發育或死亡。胡天華等人從煙草中分離出流行於我國的黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),並克隆了編碼該病毒外殼蛋白的cDNA基因(胡天華等,1989)。王春香等從感病的煙草葉片中分離純化了馬鈴薯x病毒 (potato virus X, pvx),克隆了完整的馬鈴薯x病毒外殼蛋白基因,並將外殼蛋白基因轉入馬鈴薯中,以期獲得抗pvx病毒的栽培種馬鈴薯(王春香等,1991)。病毒外殼 蛋白(Coat protein cp)基因的成功克隆,可使轉基因植物中產生病毒外殼蛋白基因介導的抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介導的抗性。Van kan 報道從真菌中成功的克隆出無毒基因Avr9,可直接利用此基因介導廣譜高效的基因工程植物(Van Kan等,1991)。我們1995年構建了天麻cDNA文庫,制備抗體探針成功地分離了編碼天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆,為抗真菌基因在農業、醫 葯等方面的應用打下了基礎(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997)。功能克隆的特點是用基因表達的產物蛋白質來克隆基因、雖然某一性狀的編碼基因是未 知的。如果對其生理生化及代謝途徑研究的比較清楚,就可以分離和純化控制該性狀的蛋白質。因此功能克隆的關鍵是分離出一個純度很高的蛋白質。只要有一個純 的蛋白質,得到十分特異的探針,這一策略是行之有效的。採用功能克隆方法雖然已經克隆了很多基因,但由於絕大多數基因的產物目前還不知道。所以大多數基因 難以用這一經典的方法來克隆。隨著分子生物學技術的發展,一條新的基因克隆策略逐漸形成,這就是定位克隆。
2定位克隆(Positional cloning)
根據遺傳連鎖分析,染色體步移將基因定位到染色體的一個具體位置上後不斷縮小篩選區域進而克隆該基因,研究該基因的功能或抗性的生化機制,這樣一種策略 叫定位克隆(Monaco,1994)。連鎖分析即通過基因與DNA標記之間的重組系數來估計這兩者之間的距離,若某種性狀的基因與DNA標記在子代不分 離,即有連鎖在一起的趨勢。根據這一原理可將與已知的某一DNA標記連鎖的基因在染色體上定位。由於連鎖分析需要依賴特定的基因作為連鎖標記,即標記基因 與待研基因之間存在連鎖關系,而滿足與待研基因相連鎖的基因實在太少,所以連鎖分析對克隆大多數基因存在著一定的困難。RFLP的出現使多態性基因標記存 在於整個基因組內,解決了連鎖分析中難以克服的困難。
1980年Wyman等科學家首次建立了限制酶切片段長度多態性RFLP (restriction fragment length polymorphism),使對任何一種表型相關的基因的定位成為可能。限制酶切片段長度多態性是用限制性內切酶切割後產生的DNA片段長度的多態性呈 孟德爾式遺傳,是存在於全基因組的獨特的多態標記,RFLP使基因定位變得易行(Wyman等,1980)。目前定位克隆一般是用RFLP等分子標記製作 遺傳圖譜,尋找與待測基因連鎖的RFLP標記,獲得基因在染色體上的定位然後克隆基因。所以RFLP和後來發展起來的RAPD技術的建立,可將待測基因相 對准確地定位,利用已知的基因可分離與之連鎖的未知基因。其基本程序是構建一個基因組文庫、用已知的A基因為探針,從基因組文庫中篩選出與其有同源序列的 a克隆,再用a克隆為探針從基因組文庫中篩選出與a克隆有同源序列的b克隆,然後以此類推最後篩選出未知基因並把它分離出來。目前已在番茄、煙草、大麥、 水稻、大豆、玉米等植物中發現了與抗病基因緊密連鎖的RFLP標記並構建了遺傳圖譜(Figdore等,1988;Heun等,1991;Smith, 1991;Diers等,1992)。用這種方法已分別克隆到擬南芥菜、番茄、水稻等植物中的有關抗病基因(Martin等,1993;Bent等, 1994;Mindrinos等,1994;Wenyuan等,1995) 。Martin等1993年最早用定位克隆技術克隆出番茄pto基因,pto基因負責對帶有無毒基因Avrpto的細菌,丁香假單胞菌 (pseudomonas syringae pv)菌株的抗性,Pto基因導入感病番茄後轉基因植株增強了對病原菌的抗性(Martin等,1993)。Wenyuan等1995年用這一技術克隆了 水稻Xa21基因,Xa21基因對真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)具有抗性(Wenyuan等,1995)。
3轉座子標記法(transposon tagging)
轉座子是可從 一個基因位置轉移到另一位置的DNA片段。在轉座過程中原來位置的DNA片段(轉座子)並未消失,發生轉移的只是轉座子的拷貝、基因發生轉座可引起插入突 變使插入位置的基因失活並誘導產生突變型或在插入位置上出現新的編碼基因。通過轉座子上的標記基因(如抗葯性等)就可檢測出突變基因的位置和克隆出突變基 因來。轉座子標記法是把轉座子作為基因定位的標記和通過轉座子在染色體上的插入和嵌合來克隆基因(Fedoroff等,1984;Jones等, 1994)。
利用轉座子克隆植物基因的操作步驟主要應是以下幾方面:(1) 把已分離得到的轉座子與選擇標記構建成含轉座子的質粒載體。(2) 把轉座子導入目標植物。(3) 利用Southern雜交等技術檢測轉座子是否從載體質粒中轉座到目標植物基因組中,這是轉座子定位和分離目標基因所不可缺少的。(4) 轉座子插入突變的鑒定及其分離(Ellis等,1992)。通常用於克隆植物基因的轉座子有玉米的Ac. Mu, Smp和Ds等。Ac含有編碼轉座酶的基因,能夠自主的轉座,Ds不含轉座酶所以不能自主的轉座,但Ds-Ac系統因Ac為Ds提供了轉座酶就可以自主的 轉座了。用轉座子標記法進行植物基因的分離,首要的是把Ac等轉座子轉化到要進行基因克隆的植物中,目前多數是利用土壤農桿菌介導的轉化系統把轉座子導入 目標植物中(Keller等,1993;Bancroft等,1993)。目前已在玉米、煙草、番茄、亞麻等植物中克隆出抗性基因(Johal和 Briggs,1992;Whitham等,1994;Jones等,1994;Gregory等,1995)。Johal和Brigge分離出抗灰色長 蠕孢(Helminth osporium carbonum)1號小種玉米的HMI特異真菌抗性基因。該基因存在於玉米的抗性品種中,能夠分解長蠕孢1號小種產生的對玉米具特異致病性的HC毒素, 該基因編碼HC毒素脫毒酶可使植物具有抗病性(Johal和Briggs,1992)。和轉座子標記法的原理相似的還有T-DNA標記法,兩者都是由於一 段基因的插入導致染色體結構發生變化產生突變體,而T-DNA標記法產生的突變是由於T-DNA插入導致的。Kenneth等利用T-DNA插入標記培育 出擬南芥矮化突變體(Kenneth等,1989)。
4人工合成並克隆基因
蜘蛛毒素是一種小肽,它只有37個氨基酸,體外實 驗表明它能殺死多種對農作物有害的昆蟲,蔣紅等1995年根據蜘蛛毒素的氨基酸序列,採用植物偏愛密碼子、人工合成並克隆了此肽的基因(蔣紅等, 1995)。Adang 1995年人工合成了蘇雲金桿菌毒蛋白(Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein)基因(Adang等,1995)。
5表型克隆(phenotype cloning)
1995年Jonsson和Weissman提出表型克隆概念(Jonsson和Weissman,1995),有些植物目前即不了解它的基因產物,也沒 有對它們進行基因定位,但已知植物在表型上存在差異,利用表型差異或組織器官特異表達產生的差異來克隆植物基因就是表型克隆。San等用表型差異從擬南芥 中克隆出赤黴素合成酶基因(Sun等,1992)。表型克隆在策略上試圖將表型與基因結構或基因表達的特徵聯系起來,從而分離特定表型相關基因,力求不必 事先知道基因的生化功能或圖譜定位，根據基因的表達效應就直接分離該基因(Brown,1994)。
6mRNA差異顯示(mRNA differential display)
1993年Liang和Averboukh 等科學家提出了mRNA差異顯示(mRNA DD, mRNA differential display)的方案(Liang等,1993)。這一方案的依據是在高等真核生物中所有的生命過程和病理變化,不論是由單基因控制的還是由多基因控制 的,最終都是通過基因表達的質或量的差異而體現出來。研究基因表達差異,研究兩基因組差異表達基因的分離,為克隆復雜性狀相關基因開辟了重要的途徑。該方 案可以檢測、分離出全長任何部分有突變的mRNA,其基本程序是:(1)提取兩種細胞的mRNA,反轉錄後成為2種cDNA。(2) 以一定的引物作隨機聚合酶鏈反應。(3) 通過擴增產物的電泳分析,分離出不同樣品間的差異條帶。(4)將差異DNA做成探針。(5) 在cDNA文庫或基因組文庫中篩選基因並作功能分析(Baeur等,1993)。Liang和Pardee又建立了mRNA差別顯示PCR方法 (Liang和Pardee,1992),該方法可以同時分析幾個樣品間基因的表達,檢測靈敏度高,PCR擴增後,一些表達量很低的mRNA也能被檢測出 來,應用PCR及DNA測序，兩種技術簡單易行,目前已被成功地用來分離小麥熱激蛋白基因(Joshi等,1996)和水稻蔗糖調節基因(Tseng等, 1995)等。
7減法雜交(Subtractive hybridization)
Lee等1991年提出減法雜交技術 (Lee等,1991),植物在生長發育過程中不同組織或同一組織的不同發育階段,由於基因特異性的表達,其mRNA表現不同,這樣從表達特異基因的組織 中提取 mRNA,反轉錄為cDNA,從無特異基因表達的組織中提取mRNA,兩者雜交,在表達特異基因的組織和無特異基因表達的組織中均表達的基因產物形成雜交 分子,而特異mRNA轉錄的cDNA仍保持單鏈狀態,把這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達的基因,Chong等用此技術克隆了小麥春化相關基因 (Chong等,1994)。
8PCR擴增克隆
這是一種參考已知基因的序列克隆基因的方法。目前已經知道了很多植物基因的序 列,當克隆類似基因時可先從Gene bank庫中找到有關基因序列,用PCR方法克隆不同植物的基因。基本方法是根據已知基因的序列設計並合成一對引物,從植物中提取DNA進行PCR擴增, 擴增的片段純化後連接到合適的載體上,用酶切分析和序列分析檢測重組子,並與已知基因序列進行比較,如目前已在玉米、水稻、向日葵、巴西豆等植物中分離出 富含甲硫氨酸的蛋白及其編碼基因,根據Masumura等(1989)發表的10KD水稻醇溶蛋白基因序列合成一對引物,王廣立等克隆了水稻10KD醇溶 蛋白基因(王廣立等,1994)。
9依據序列同源性克隆基因
生物的種、屬之間編碼基因序列的同源性高於非編碼區的序列。此方 法的基本作法是在其它種屬的同源基因被克隆的前提下,構建cDNA文庫或基因組文庫,然後以已知的基因序列為探針來篩選目的克隆。馬德欽等根據文獻報道的 甜菜鹼醛脫氫酶(BADH)基因的序列作了菠菜甜菜鹼醛脫氫酶基因的克隆和序列分析(馬德欽等,1996)。
綜上所述,可見發現和克隆基 因的過程是艱巨和富有收獲的,幾十年來各國科學家在基因克隆這一最激動人心的生物高技術領域內走過了艱難而又曲折的歷程,從而創造和發展了上述種種植物基 因克隆的方法,使人類在認識自然、掌握自然的道路上又前進了一步。前輩所創造的成就和技術無疑為我們成功地克隆植物基因提供了快捷和高效的途徑。利用已知 序列克隆基因,用同種或同屬的已知的同源序列篩選基因都比較容易,適合於克隆那些研究較晚的許多重要農作物的基因。獲得極純的蛋白質是功能克隆的關鍵,隨 著蛋白質純化技術的提高,功能克隆將發揮它的潛在作用。隨著植物遺傳圖譜上基因定位基礎研究工作的提高,定位克隆將發揮其巨大的作用。

❺ FDA 的Complete Response Letter 是什麼意思

以下內容轉自鏈接：http://news.dxy.cn/bbs/topic/19133872

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Complete response letter means a written communication to an applicant from FDA usually describing all of the deficiencies that the agency has identified in an application or abbreviated application that must be satisfactorily addressed before it can be approved.

相當於國內的補充通知。

http://www.fda.gov/Drugs//LawsActsandRules/ucm084138.htm

The Food and Drug Administration (FDA) is amending its regulations on new drug applications (NDAs) and abbreviated new drug applications (ANDAs) for approval to market new drugs and generic drugs (drugs for which approval is sought in an ANDA). The final rule discontinues FDA』s use of approvable letters and not approvable letters when taking action on marketing applications. Instead, we will send applicants a complete response letter to indicate that the review cycle for an application is complete and that the application is not ready for approval.

另外還可以學習這篇文章：

FDA擬向葯品申報者提供更明確的新葯申請審查信息

FDA正計劃調整新葯和通用名葯的審查程序，即通過以「完全回應函」（complete response letters）代替「可批准函」（approvable letters）和「不可批准函」（not approvable letters），向公司提供關於其所申請葯品在獲准上市前還需補充事項的具體信息。FDA已在生物製品的審查中採取這種方式有些時日，將通過此計劃使其正式用於所有葯品中。
該規章草案稱為《用於批準的上市新葯申請；完全回應函；對未批准申請的修正》（Applications for Approval to Market a New Drug; Complete Response Letter; Amendments to Unapproved Applications），文號（Docket No.）2004N―02671。
這些調整將保證FDA使用一種唯一、一致的方式告知葯品生產商，FDA對葯品申請的審查是完全的。
「這一新措施將提供一種更明確和更一致的方式，就新葯和通用名葯的申請情況與申請者進行溝通，」FDA代理局長Lester M. Crawford博士說。
此外，該項計劃將修正關於延長審查周期的相關規定。延長審查周期，以對未獲批準的申請作出增補，並在作為對「完全回應函」回答的重新報送後開始新的審查周期。
根據現行規章，在收到「可批准函」或「不可批准函」後，新葯或通用名葯上市申請的重新報送延長審查期。
根據新規章草案，新葯申報者對新葯申請「完全回應函」的反應，將根據為得到上市批准需要補充的事項內容進行分類。一種「第1級」（Class 1）重新報送被定義為收到只包含某些項目的「完全回應函」後所重新報送的申請，這些項目如草擬或最終的印刷標識、安全性或穩定性資料更新、或者其它次要證明資料。「第1級」重新報送將啟動為期2個月的新一輪審查周期。
一種「第2級」（Class 2）重新報送，對資料的要求高於「第1級」重新報送（例如，需要在公開咨詢委員會會議上討論的資料）。「第2級」重新報送將啟動為期6個月的新一輪審查周期。
FDA的規章草案將保留通用名葯申請重新報送中現行的「主要」（major）和「次要」（minor）兩個術語。根據該草案，一種「主要」通用名葯上市申請重新報送，將啟動為期6個月的新一輪審查周期。一種「次要」通用名葯申請重新報送，將啟動為期30天至若干個月的新一輪審查周期，具體時限視所涉及的問題而異。
計劃對規章的這些調整是為了實現《2002年處方葯用戶收費修正案》（Prescription Drug User Fee Amendments of 2002）(稱為PDUFA III)中所涉及的用戶收費績效目標（user fee performance goals），其中有審查人用葯品申請的程序和目標時間框架。
FDA承諾與《1992年處方葯用戶收費法》(Prescription Drug User Fee Act of 1992，PDUFA)相結合，在人用新葯申請的審查和決定方面達到若干目標。FDA的葯品申請績效目標（drug application review performance goals），因《1997年FDA現代化法》（Food and Drug Administration Modernization Act of 1997）（此法中的用戶收費條款被稱為PDUFA II）的制定而作了修改。
FDA的績效目標與PDUFA III的制定相結合，作了進一步修改。PDUFA III是在《2002年公眾健康安全和生物恐怖活動防範與應對法》（Public Health Security and Bioterrorism Preparedness and Response Act of 2002）中規定的。PDUFA III第502節指出：用戶收費將被專門用於加快符合新績效目標的葯品開發過程和人用葯品申請的審查過程。
FDA的規章草案7月19日公布於《聯邦登記簿》辦公室（Office of the Federal Register）和以下網址：http://www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS/98fr/04n-0267-npr0001.pdf。
相關意見，以文號加以鑒別，可於2004年10月18日前在英特網上通過聯邦電子規章制定埠（Federal e-Rulemaking Portal）：http://www.regulations.gov或通過FDA網站（FDA Web Site）：http://www.fda.gov/dockets/ecomments送交FDA。
這些網站提供關於送交意見的指導。意見也可通過E-mail發送至：[email protected]，請注意在e-mail信息的主題欄（subject line）中填入文號；或者傳真至：301-827-6870。
收到的所有意見將不加變化地公布於http://www.fda.gov/dockets/ecomments。這些意見還將交由文檔管理部（Division of Dockets Management）的人審查。文檔管理部的地址：5630 Fishers Lane, Room 1061, Rockville, Md. 20852，美國）。

http://www.fdc-intl.com/detail_info/detail_509.html
2011-01-02 17:21
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2014年度國家星火計劃項目開始申報

樓主
liyong_029
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3樓
多謝熱心朋友llb1978
2011-05-13 16:53
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• 猜猜這是什麼病？

白喑月
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4樓
謝謝，學習了
2013-09-18 15:12
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人外周血單個核細胞(PBMCs)，Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs),1

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❻ 文章沒有PMID,可以使用丁香園求助嗎

請電腦端下載附件吧，文獻已給你上傳，希望對你的研究有所幫助，還專望採納屬答案 ednasopharyngealcarcinoma.

❼ 丁香園文獻求助為什麼需要丁當了

以前不需要是因為網站宣傳，現這個方面已經被大家認可了，一方面網站可以賺錢，一方版面權網站通過丁當這個虛擬錢幣進行各個方面的銜接運作，就像其他購物網站一樣。怎麼才能獲得免費文獻，首先先在網路、谷歌等各個搜索引擎上進行搜索，其次求助你的大學同學，一般各個高校會購買不同文獻資源可以下載全文。

❽ 丁香園文獻求助求助

個人認為效果挺好的，都停葯好久了，沒反彈

❾ 丁香園里的文獻求助是求助翻譯嗎

求助的文獻的全文下載。
只知道題錄信息不下不到全文，這和國內不同機構圖書館的下載許可權有關

❿ 丁香園的文獻互助是否有版權風險

你好，如果B是原創作品，且屬於版權人，這是沒有問題。無版權授權的上傳、下載都是侵權的。